Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Gerstengenen, die zur Resistenz gegenüber Fusariumpilzen beitragen
Identification and functional analysis of barley genes that improve the resistance of cereals to fungi of the genus Fusarium

Gruppenleiter: Dr. rer. nat. Carin Jansen
Mitarbeiter: Rebekka Fensch, Dipl. biol. Sibylle von Rüden (PhD student), Dr. agr. Cléberson Fernandes, Lenka Malinowski (Master student)

Das vom BMBF geförderte Verbundprojekt GABI-Agrotec wurde im April 2002 als Teil des Programms GABI (Genomanalyse im biologischen System Pflanze) ins Leben gerufen. Neben dem IPAZ (Institut für Phytopathologie und Angewandte Zoologie) der JLU Gießen sind an GABI-Agrotec die Abteilung Molekulare Phytopathologie und Genetik des Biozentrums Klein Flottbek der Universität Hamburg und das Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) in Gatersleben beteiligt. Ziel des Projekts ist die Isolierung und funktionelle Überprüfung von Gerstengenen, die zur Resistenz von Getreide gegenüber Pilzen der Gattung Fusarium beitragen.
Fusariumpilze gehören zu den sogenannten Feldpilzen und führen auch in Mitteleuropa zu erheblichen Ernteverlusten besonders im Weizen- aber auch im Maisanbau. Das typische Symptom einer Fusarium-Infektion im Weizenfeld ist die partielle bzw. völlige Taubährigkeit (Bild 1). Pilze der Gattung Fusarium sind allerdings nicht nur auf Grund ihrer ertragsreduzierenden Eigenschaften ins Zentrum des öffentlichen und wissenschaftlichen Interesses gerückt, sondern insbesondere durch die von ihnen produzierten Toxine (Mykotoxine), die z.T. auch in Nahrungsmittel gelangen und zu erheblichen gesundheitlichen Problemen führen können.
Da keines der zurzeit auf dem Markt erhältlichen Fungizide einen ausreichenden Schutz gegenüber Fusariumpilzen gewährleistet, bemühen sich Pflanzenzüchter und Phytopathologen gleichermaßen um eine Lösung der Fusarium-Problematik.
Bild 1. Partielle bzw. vollständige Taubährigkeit beim Weizen verursacht durch eine Infektion mit Fusariumpilzen. Das Einwachsen des Pilzes in die Ährenspindel führt zu einer derart massiven Zerstörung des Gewebes, dass die Nährstoffversorgung zum darüber liegenden Teil der Ähre abgeschnitten wird. Dieser Bereich bleicht in der Folge aus und stirbt schließlich ab.
Isolierung von Kandidatengenen über cDNA-Arrays
Der Kontakt zwischen einer Pflanze und einem Krankheitserreger führt immer zur Aktivierung von Abwehrmechanismen, mit denen die Pflanze versucht, die Ausbreitung des Pathogens und damit einen Befall zu verhindern. Die Schnelligkeit und die Stärke, mit der bestimmte Reaktionen erfolgen, sind oftmals entscheidend für den Erfolg der pflanzlichen Abwehr. Grundvoraussetzung für alle Abwehrprozesse ist die Aktivierung von Resistenz-vermittelnden Genen, deren Produkte z.B. antifungale Wirkung besitzen oder den Eintritt des Pathogens ins Pflanzengewebe verhindern.
Daher ist es das primäre Ziel von GABI-Agrotec, Gene der Modellpflanze Gerste (Hordeum vulgare L.) zu identifizieren, die bei einem Befall mit Fusariumpilzen in Ähren, Wurzeln und Blättern besonders aktiviert werden, d.h. deren Expression im Vergleich zum nicht-infizierten Zustand verstärkt ist. Diese Gene werden mit Hilfe sogenannter cDNA-Arrays (Bild 2) gefunden. Dabei handelt es sich um Filter, auf denen fast 5.000 verschiedene mRNA (messenger RNA, Boten-RNA) aufgebracht wurden, die verschiedene Gene der Gerste repräsentieren.
Bild 2. Ausschnitt aus einem cDNA-Array, der auf einer Fläche von etwa 9 x 13 cm ca. 5.000 mRNA Fragmente enthält. Die Aktivität der korrespondierenden Gene wird in nicht-infizierten und Fusarium-infizierten Geweben der Gerste mit Hilfe Computer-gestützter Analysen bestimmt.

Durch den Vergleich des Aktivitätszustands der verschiedenen Gene sowohl in nicht-infizierten als auch in Fusarium-infizierten Gerstenähren, -wurzeln und –blättern, werden solche Gene selektiert, deren Expression durch einen Fusariumbefall in besonderem Maße verstärkt wird.

Genfunktions-Assays zur Identifizierung von Determinanten der Resistenz: Das Arabidopsis-Fusarium Pathosytem

Da die stabile Transformation von Getreide sehr langwierig ist, wurde zur schnellen funktionellen Analyse der Kandidatengene ein Pathosystem etabliert, in dem A. thaliana als Wirt für Fusarium dient. Da eine hohe Homologie zwischen Gerste und Arabidopsis besteht, können über Datenbankvergleiche für viele Gerstengene entsprechende Homologe in Arabidopsis gefunden werden. Für viele dieser Arabidopsisgene existieren Insertionslinien, d.h. Mutanten, in denen das Kandidatengen nicht mehr funktional ist. Diese Insertionslinien können von öffentlichen Stockcentern problemlos bezogen werden. Als Pathogene setzten wir neben den in der Literatur beschriebenen F. oxysporum Stämmen, ebenfalls die Getreidepathogene F. culmorum und F. graminearum ein, da eine erfolgreiche Infektion von F. culmorum auf Arabidopsisblättern bzw. von F. culmorum und F. graminearum an Arabidopsiswurzeln etabliert werden konnte (Bild 3).

Bild 3. Bildung von Konidien von F. culmorumauf einem Blatt von A. th.a, 8 Tage nach künstlicher Infektion (A). Starker Befall einer A. th. Wurzel durch einen GFP-exprimierenden Stamm von F. graminearum, 3 Tage nach künstlicher Infektion (B).
Genfunktions-Assays zur Identifizierung von Determinanten der Resistenz: Test stabil transformierter Getreidepflanzen
Abschließend wird die Beteiligung der Kandidatengene an der Resistenz gegenüber Fusarium auch in Getreide in funktionellen Assays überprüft. Dazu werden die Kandidatengene in bestimmte Expressionsvektoren eingebracht, die über Agrobakterien in Weizen- und Gerstenpflanzen überführt werden. Die verschiedenen Organe (Wurzeln, Blätter, Ähren) der transformierten Pflanzen werden mit Fusariumpilzen inokuliert und durch den direkten Vergleich mit nicht transformierten Kontrollpflanzen kann abgeschätzt werden, ob das verwendete Kandidatengen einen Einfluss auf die Stärke des Pathogenbefalls bzw. die Resistenz der Pflanze hat.
Der Befall von Gersten- und Weizenwurzeln (Bild 4A) mit Fusarium kann, wie die Infektion von Gersten- und Weizenblättern (Bild 4B), besonders schnell und reproduzierbar untersucht werden. Die Bestimmung der Befallsstärke erfolgt zunächst makroskopisch durch Ausmessen des nekrotisierten Bereichs des infizierten Pflanzenorgans. Wenn der Befall in transformierten Pflanzen gegenüber dem der Kontrolle reduziert ist, erfolgt eine genaue mikroskopische Analyse, um mögliche Veränderungen auf zytologischer Ebene aufzudecken.
Bild 4 A/B. Infektionen von Fusarium culmorum an Wurzeln (A) und Primärblättern (B) der Gerste. Der Befall der Wurzel führt zu einer starken Verbräunung (Nekrotisierung) und deutlichen Reduktion der Länge in Vergleich zur nicht-infizierten Kontrolle, die links im Bild zu sehen ist. An Blättern verursacht Fusarium gelb-braune Läsionen, d.h. Bereiche, in denen das Pflanzengewebe großflächig abgestorben ist. Beide Bilder wurden 7 Tage nach künstlicher Inokulation aufgenommen.
 
Ebenso wird die Anfälligkeit der Ähre transformierter Getreidepflanzen in Inokulationsexperimenten überprüft. Dazu werden einzelne Ähren mit einer Sporenlösung von F. graminearum besprüht und nach etwa 3 Wochen der prozentuale Anteil befallener Ährchen bestimmt.
Untersuchung von gezielt ausgewählten Kandidatengenen
Fusariumpilze sind nekrotrophe Pathogene, d.h. dass sie das Pflanzengewebe, in das sie eindringen, abtöten und sich vom toten Zellmaterial ernähren. Auf Grund dieser Lebensweise ist es eine denkbare Strategie, den Pilz in seiner Entwicklung dadurch zu hemmen, dass man die attackierten Pflanzenzellen am Leben erhält. Mit dieser Aufgabe sind in Pflanzenzellen verschiedene Gene betraut, von denen einige auch in Gerste bereits isoliert und charakterisiert worden sind. Diese Zelltodinhibitorgene sollen ebenso wie die Kandidatengene aus dem GABI-Agrotec Projekt in funktionellen Assays auf ihre Resistenz-vermittelnde Wirkung im Getreide-Fusarium Pathosystem untersucht werden.
Zytologische Untersuchung der Getreide-Fusarium Interaktion
Über die zytologischen Details der Getreide-Fusarium Interaktion ist bislang nur sehr wenig bekannt. Dies mag daran liegen, dass die mikroskopische Untersuchung des Pilzes sehr schwierig ist, da er eine exzessive Myzelbildung zeigt und nur schwer im Pflanzengewebe zu erkennen bzw. durch Färbemethoden sichtbar zu machen ist. Durch die Kooperation mit der Abteilung Molekulare Phytopathologie und Genetik des Biozentrums Klein Flottbek der Universität Hamburg stehen uns Fusarium graminearum Stämme zur Verfügung, die mit dem gfp-Gen, das für das grün fluoreszierende Protein kodiert, transformiert wurden. Diese Pilze leuchten bei Anregung mit UV-Licht grün und sind daher sehr leicht auf und im pflanzlichen Gewebe zu detektieren. Der Infektionsverlauf von F. graminearum wird in allen Schichten der Karyopse, an isolierten Epikarpien (Bild 5) und in Querschnitten der Karyopse (Bild 6) dokumentiert.
 
Bild 5. Hyphe eines GFP-exprimierenden Fusarium graminearum Stamms in Zellen des Epikarps, d.h. der äußeren Zellschicht einer Gerstenkaryopse. Die Aufnahme erfolgte 48 Stunden nach künstlicher Inokulation.
 
Bild 6: Querschnitt einer Gerstenkaryopse, 72 Stunden nach künstlicher Inokulation. Grün-fluoreszierendes Pilzmycel ist in den aüßeren beiden Zellschichten der Hypodermis zu erkennen.

Die hier vorgestellten Arbeiten sollen letztlich dazu dienen, sowohl die zellulären als auch die molekularbiologischen Ereignisse der Getreide-Fusarium Interaktion aufzuklären.
Englische Literatur: 
Jansen C, Schuphan I, Schmidt B (2000): Glufosinate metabolism in excised shoots and leaves of twenty plant species. Weed Science 48 (3), 319-326. 
Jansen C, Korell M, Eckey C, Biedenkopf D, Kogel K-H (2001): Molecular analysis of Mlg-mediated resistance and CIR in barely/powdery mildew-pathosystem: II. Investigation of differential gene expression by SSH and RGA. Abstracts International Workshop “Durable resistance in cereals – SAR and other strategies to improve plant production”, Rauischholzhausen 29.03-01.04., 47. 
Jansen C, Stein E, Fensch R, Kogel K-H (2002): A genomic approach towards disease resistance to Fusarium. 7th European Seminar on Fusarium-mycotoxins, taxonomy and pathogenicity, 4.-7. Sep. 2002, Poznan, Poland; Book of abstracts, p. 120. 
Jansen C, von Rüden S, Fensch R, Kogel K-H (2003): Consistency between degree of susceptibility of barley root and spike tissue to Fusarium culmorum. Mycotoxin Research 19, 134-138 
Eckey C, Korell M, Leib K, Biedenkopf D, Jansen C, Kogel K-H (2004): Identification of powdery mildew-induced barley genes by cDNA-AFLP: functional assessment of an early expressed MAP kinase. Plant Molecular Biology 55: 1 - 15. 
Jansen C., Korell M., Eckey C., Biedenkopf D., Kogel K.-H. (2005): Identification and transcriptional analysis of powdery mildew-induced barley genes. Plant Science 168, 373-380.
Jansen, C., Maier, F., Fensch, R., von Wettstein, D., Kogel, K.-H. und Schäfer, W. (2004): Cytological analysis of the infection course of Fusarium graminearum on barley caryopses. Proceedings of the 2nd International Symposium on Fusarium Head Blight (2), p 459.
Deutsche Literatur:
Jansen C, Korell M, Eckey C, Kogel K-H (2000): Molekulare Analyse im Gerste/Mehltau-Pathosystem: II Darstellung differentieller Genexpression mittels SSH. Mitt. Biol. Bundesanst. Land- Forstwirtsch. 376, 394-395.
Jansen C, Eckey C, Korell M, Biedenkopf D, Micknass U, Kogel K-H (2001): Molekulare Analyse der Mlg-vermittelten Resistenz im Gerste/Mehltau-Pathosystem. Phytomedizin 31(2), 85-86.
Jansen C, Hückelhoven R, Fensch R, Schultheiß H, Stein E, Dechert C, von Rüden S, Kogel K-H (2003): Strategien zur Kontrolle von Fusarium in Getreide. Phytomedizin 33 (3), 28.
Jansen C, Kogel K-H (in press): GABI-Agrotec: Ein nationales Verbundprojekt zur Sicherung der Nahrungsmittelqualität von Getreideprodukten durch Grüne Gentechnik. Spiegel der Forschung, Wissenschaftsmagazin der Justus-Liebig-Universität Gießen.
Jansen, C., Kogel K.-H. (2004): GABI-Agrotec: Ein nationales Verbundprojekt zur Sicherung der Nahrungsmittelqualität von Getreideprodukten durch Grüne Gentechnik. Spiegel der Forschung, Wissenschaftsmagazin der Justus-Liebig-Universität Gießen, Jahrgang 21, Nr. ½ (ISSN 0176-3008).
Jansen, C., von Rüden, R., Fensch, R. und K.-H. Kogel (2004): Isolierung und Charakterisierung Fusarium-responsiver Gene der Gerste zur Identifizierung von Determinanten der Abwehr in Getreide.Mitt. Biol. Bundesanst. Land- Forstwirtsch. 396, 283 f.
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07.10.2005