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Projekt E3 - Proteinproduktion, HTS-Assays, Kristallisation, Interaktionsanalysen

Projektleiter
Projektleiter


 

Projektbeschreibung

Im Rahmen der Plattform [E3] sollen Methoden zur Proteinproduktion, zur Entwicklung von HTS Assays, zur Kristallisation und Strukturanalyse sowie zu Interaktionsanalysen für das DRUID-Konsortium bereitgestellt werden. Bei der Proteinproduktion kann auf große Erfahrung mit heterologer Expression von Parasitengenen insbes. in E. coli zurückgegriffen werden. Dabei kann eine Vielzahl an Optimierungsmöglichkeiten bei der Klonierung/Expression (mit N- oder C-terminalen Affinitäts-Tags, spaltbar/nicht-spaltbar, Fusionsproteine, Helferplasmide zur Codonoptimierung oder zur Faltung, Zellen für die Expression Disulfid-enthaltender Proteine oder für leicht toxische Proteine) sowie bei der Reinigung nativer Proteine (Affinitätschromatographie, Gelfiltration, Ionenaustauscher) angeboten werden. Ebenso besteht Erfahrung mit der heterologen Überexpression von Selenoproteinen, die einer speziellen Translationsmaschinerie bedürfen.1 Hochskalierung der Kulturvolumina auf bis zu 20 l bei verschiedenen Temperaturen ist möglich. Danach würde man – bei Bedarf – versuchen, die Bedingungen auf die Plattformen der THM zu übertragen. Für erfolgreich rekombinant produzierte Proteine kann über die Plattform [E3] Unterstützung bei der Entwicklung von Assaysystemen bis hin zu high throughput-fähigen Formaten gegeben werden. Für das eigentliche HTS-Screening bestehen bereits Kontakte u.a. zum Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA, zur Screening Unit des NIH, Bethesda sowie dem Hamburg Screening Port.

Abb. E3. Kristallstruktur der Thioredoxinreduktase im Komplex mit ihrem physiologischen Substrat Thioredoxin 1.

 

Des Weiteren soll über das Projekt [E3] Zugang zu der Kristallisationsplattform am IFZ ermöglicht werden.2,3 Für Kristallisationscreens im nl-Massstab stehen ein Pipettier- sowie ein Kristallisationsroboter (Honeybee, Zinsser Analytic) sowie Starterkits (Qiagen/Jena Bioscience) und diverse Additivscreens zur Optimierung zur Verfügung. Frau Dr. Fritz-Wolf wird als Kristallografin und Ansprechpartnerin fungieren und kann die ersten Testungen der Kristalle vornehmen. Hierzu stehen die Röntgenquellen des Max-Planck-Instituts für Med. Forschung (Heidelberg) bzw. der AG Klebe/Heine [A5] (Marburg) zur Verfügung. Für molekulare Interaktionsanalysen (Protein-Protein oder Protein-Ligand-Wechselwirkungen) mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) kann über die Plattform [E3] auf ein Biacore T200-System zugegriffen werden. Mittels SPR können quantitative und hochsensitive biomolekulare Interaktionsanalysen in Echtzeit ohne jegliche Markierung durchgeführt werden. Dabei kann sowohl die Spezifität als auch die Kinetik und Affinität einer Interaktion analysiert werden.4 Eine Adsorption von Lipideinfach- und -doppelschichten ist ebenfalls möglich.

 

Literatur E3: 1. Fritz-Wolf et al. (2011) Nat Commun 2:383* 2. Koncarevic et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106:13323-8*  3. Kehr et al. (2010) PLoS Pathog 6:e1001242* 4. Bathke et al. (2016) J Mol Biol 428, 4946-4961*

*eigene Publikationen