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Projekt E5 - Prozessentwicklung/-kontrolle, Produktion von Proteinen und Viruspartikeln

Projektleiter

 

 

Projektbeschreibung

Das IBPT arbeitet an Plattformtechnologien und Verfahren für die zell- und partikelbasierte Therapie, mit der Möglichkeit der Optimierung und Kontrolle der Stofftransportvorgänge durch moderne bildgebende Verfahren auf zellulärer Ebene sowie begleitender Prozessanalytik auf der Basis automatisierter Verfahren. Dabei werden die ingenieurwissenschaftlichen Fragestellungen zur Entwicklung von zulassungsgerechten nano- und mikropartikulären Transportsystemen zur Therapie, die Entwicklung von zulassungsgerechten Reaktionssystemen für die zellbasierte und nanopartikuläre (Viruspartikel) Therapie sowie die Optimierung und der Scale-up von Zellkultivierungssystemen (Stammzellen, Insektenzellen) bearbeitet.

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Abb. E5. Darstellung der geplanten Arbeitsprozesse.

So arbeitet die AG Czermak an der Charakterisierung und Optimierung von GMP konformen Prozessen zur Expansion und Ernte von Stammzellen für die Therapie sowie an der Charakterisierung und Optimierung von Prozessen zur Herstellung und Aufreinigung onkolytischer Masernviren für die Krebstherapie. Darüber hinaus werden Fragestellungen zu PAT und GMP bei der Prozessentwicklung für die Herstellung von Arzneimitteln für neuartige Therapien (Advanced Therapy Medicinal Products, ATMP) bearbeitet. Dazu steht die Expertise des IBPT der THM auf diesen Gebieten zur Verfügung. Neben der Entwicklung von Bioreaktionssystemen erfolgen auch Forschungs- und Entwicklungsarbeiten für downstream Prozesse von zell- und virusbasierten therapeutischen Produkten sowie Transfer und Unterstützung bei der Überführung von Prozessen in die Produktion. Darüber hinaus ist ein Schwerpunkt der Arbeitsgruppe die rekombinante Herstellung von Proteinen/Peptiden, wobei folgende Entwicklungen und Fragestellungen bearbeitet werden: i) die wissensbasierte Auswahl des geeigneten Expressionssystems -> erfolgreich etablierte Expressionssysteme, die auch im Rahmen der Golden Gate Klonierung weiterentwickelt werden: E. coli, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, die Insektenzellen S2, Sf9/21. Darüber hinaus stehen verschiedene tierische Zellen zur Verfügung (z.B. CHO, Vero) ii) die Prozessentwicklung unter Berücksichtigung der GMP und PAT Richtlinien und Empfehlungen für upstream und downstream Prozesse sowie Anwendungs-untersuchungen in den verschie-denen Bereichen, iii) die Integration von “single use” Einheiten in das Upstream und Downstream Processing iv) Know-how und Prozesstransfer sowie

Scale-up/Scale-down Studien. Neben der Optimierung des Proteins/Peptides z.B. über Protein Engineering ist die Entwicklung eines geeigneten Expressionssystems für den Produktionsprozess zur standardisierten Herstellung und die Wirkstoffformulierung entscheidend für eine therapeutische Anwendung. So wurde z.B. die gesamte Prozesskette (Identifizierung, Charakterisierung, Expression, Aufreinigung, Formulierung, Wirkungsstudien) am Beispiel des Insect Metalloproteinase Inhibitors IMPI erfolgreich entwickelt und durchgeführt. Dazu wurde mittels der Golden Gate Klonierung ein Expressionsstamm entwickelt (E. coli Rosetta Gami 2 (DE3) pLysS Plasmid GG49: T7-Promotor, GST-Fusionsprotein, Thrombin-Schnittstelle, IMPI, T7-Terminator), der die Disulfidbrücken des Peptids bilden kann und das Peptid in seiner löslichen Form (durch Integration eines Fusionsproteins) im Cytoplasma exprimiert, die Fermentation optimiert und eine Aufreinigungsstrategie entwickelt. Um erste Toxizitätsstudien und Tierversuche zu starten, wurde im 20 l Maßstab mehrfach produziert, aufgereinigt und das Produkt an das Fraunhofer ITEM, Hannover, gegeben. Das aufgebaute Know-how zum Aufbau einer Plasmidbank auf dem Golden Gate Klonierungsprinzip kann dem Konsortium zur Verfügung gestellt werden. Diese enthält diverse Sets von Promotoren, Tags, Fusionsproteinen, Proteaseschnittstellen und bereits in der FhG identifizierte peptides of interest (POI). Diese Plasmidbank ist beliebig erweiterbar, wenn neue interessante Tags oder Fusionspartner identifiziert werden, und erlaubt auch völlig tag-freie Produktion der POIs. So wurde die Expression von Gloverin mittels Insektenzellen (BVES, S2), die Herstellung des antifungalen Peptids AFP mittels E. coli und Pichia pastoris sowie des antimikrobiellen Peptids BR021 mittels E. coli und Insektenzellen (S2) erfolgreich durchgeführt.

Die Charakterisierung und Optimierung eines Herstellungsprozesses für einen rekombinanten Impfstoff mit dem Baculovirus Expressionssystem konnte unter Anwendung von PAT (Process Analytical Technology) erfolgreich umgesetzt werden.  Dabei kommt es auf exakte Einhaltung von Temperatur und Animpfstrategien an sowie auf die Sauerstoffabhängigkeit und -empfindlichkeit der Sf21-Zellen und des Baculovirus auch während der Infektion. Hinzu kommt die Ermittlung optimaler Animpftiter und eine Etablierung eines Online-Monitorings. Dies dient dazu robuste Bioprozesse zu etablieren, welche den Anforderungen von GMP und PAT entsprechen.

Literatur E5: 1. Spohner & Czermak (2016) New Biotechnol 33:473-9 2. Spohner et al. (2016) J Biotechnol 222:104-16 3. Grein et al. (2016) Process Biochem 51:1109-19 4. Weiss et al. (2015) Eng Life Sci 15:425-36 5. Kuhn et al. (2015) E J Biotechnol 18:252-5 6. Grein et al. (2014) Meth Mol Biol 1104:459-91.