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Zelldifferenzierung

Die differenzierungsinhibierende oder -stimulierende Wirkung von verschiedenen Effektoren/Substraten an Zelllinien kann mittels des p-Nitroanilide-Differenzierungsassays colorimetrisch ermittelt werden.

Prinzip des colorimetrischen Nachweises mit p-Nitrophenol
Abbildung 4.2.3
Metabolisierung des pNPP zum gelben p-Nitrophenol durch membranständige alkalische Phosphatasen lebender Zellen.

Der p-Nitrophenolphosphat-Assay (pNPP-Assay) wurde erstmals von Engvall et al. (1980) beschrieben und dient zur Bestimmung des Differenzierungsgrades von adhärenten und nicht-adhärenten Zellen. pNPP ist ein Substrat der alkalischen Phosphatase (AP). Nach Hydrolyse der Phosphatreste durch die Phosphatase entsteht p-Nitrophenol als gelbes lösliches Endprodukt. Nach Termination der Reaktion durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung kann die Intensität der Färbung colorimetrisch im ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 405nm bestimmt werden. Die Bildung des gelben Produktes ist proportional zur Aktivität der alkalischen Phosphatase.

Abbildung oben links.

 

Prinzip des fluorimetrischen Nachweises mit Fluoreszeindiphosphat (FDP)

Als Maß zur Beurteilung des Differenzierungsgrades kann die Aktivität der alkalischen Phosphatase auch fluorimetrisch bestimmt werden.
In diesem Fall wird statt dem colorimetrischen Farbstoff p-NPP der fluorimetrische Farbstoff Fluoreszeindiphosphat verwendet. Die alkalische Phosphatase ist in der Lage Fluoreszein aus dieser Verbindung freizusetzen, welches anschließend fluorimetrisch (Ex 485nm/Em 538nm) im Multiplatten- Reader gemessen werden kann.

 

Versuchsauswertung

1. Bestimmung des Proteingehaltes der Probe mittels Bradford-Assay
2. Messung der Absorption oder Fluoreszenz der Proben
3. Berechnung als µM p-NP bzw. Fluoreszein / min / mg Protein

Abbildung oben rechts.

 

Kosten (kolorimetrischer Nachweis)

  • Ca. 15 € pro 96-well-Platte 

Kosten (fluorimetrischer Nachweis)

  • Ca. 30 € pro 96-well-Platte

 

 

Anwendungsbeispiele

Untersuchungen zur Regulation von Differenzierungsereignissen im Rahmen der Zell- der Gewebshomöostase nach Supplementierung von Flavonoiden oder Oligosacchariden (Kuntz et al. 2007 and 1999)

 

Referenzen

  1. Engvall E. Enzyme immunoassay, ELISA and EMIT. Methods Enzymol. 1980;70(A):419-39.
  2. Kuntz S, Rudloff S, Kunz C. Oligosaccharides from human milk influence growth-related characteristics of intestinally transformed and non-transformed intestinal cells. Br J Nutr. 2007;10:1-10.
  3. Kuntz S, Wenzel U, Daniel H. Comparative analysis of the effects of flavonoids on proliferation, cytotoxicity, and apoptosis in human colon cancer cell lines. Eur J Nutr. 1999;38(3):133-42.