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Apoptose

Die Induktion der Apoptose führt zur Aktivierung von Caspasen. Bei diesen Enzymen handelt es sich um Cysteinproteasen, die als inaktive Proenzyme in der Zelle synthetisiert werden.

 

Prinzip (colorimetrischer Nachweis der Caspase-3)
Abbildung 4.4.1.1
Hydrolysis of the colorless substrate Ac–DEVD–pNA to the colorimetric assessable p–Nitroanilid (yellow) by activated caspase–3 as measure of an early apoptotic event.

Nach Aktivierung erfolgt die Hydrolyse der Procaspase zur aktiven Caspase. Caspasen bilden eine Familie von Proteasen, die für die Induktion des Zelltodes verantwortlich sind. Beim Menschen sind bisher 14 verschiedene Caspasen bekannt, die in Signalkaskaden angeordnet sind. Caspase-3 (CPP32, Yama, and apopain) gehört zu den kritischen Enzymen im Apoptoseprozess und im menschlichen Organismus am besten untersucht. Sie ist in der Lage, weitere Procaspasen zu aktivieren und hydrolysiert spezifisch Zellsubstrate und Strukturproteine. Resultat der Caspaseaktivierung ist somit die Fragmentierung der Zelle, die in der Bildung der ‚apoptotic bodies’ endet (Sakahira et al. 1998).

Der Caspase-3-Assay wurde erstmals von Nicholson et al. (1995) beschrieben. Der colorimetrische Caspase-3-Assay basiert auf der Hydrolyse des Peptid-Substrates Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-Nitroanilid (Ac-DEVD-pNA). Die Freisetzung das p-Nitroanilid (pNA) aus dem Peptid ist proportional zur Caspase-3-Aktivität. Das pNA absorbiert bei einer Wellenlänge von 405nm und kann im ELISA-Reader gemessen werden. Die Konzentration des freigesetzten pNA kann anhand einer Kalibrierungskurve durch eine definierte pNA-Lösung bestimmt werden; die Angabe der Enzymaktivität erfolgt als [p-NA pmol/min/mg] Protein. 

 

Abbildung oben links.

 

 

Prinzip (fluorimetrischer Nachweis der Caspase-3)

Analog zur colorimetrischen Bestimmung der Caspase-3-Aktivität kann diese mit dem fluorogenen Caspase-3-Tetrapeptid-Substrat Ac-DEVD-amino-4-methylcumarin ermittelt werden. Die hydrolytische Spaltung des Cumarinderivats durch die cytosolische Caspase-3 führt zur Bildung eines fluoreszierenden Produktes, welches nach Anregung bei 390nm und Emission bei 405nm mit Hilfe des Multiplatten- Reader bestimmt werden kann.

 

Versuchsauswertung

Entsprechend der vorher erstellten Eichgerade des p-NA bzw. Cumarinderivats kann den Messwerten eine Konzentration zugeordnet werden.

Abbildung oben rechts

 

Kosten kolorimetrischer Nachweis

  • Ca. 15 € pro 6-well-Multiplatte

Kosten fluorimetrischer Nachweis

  • Ca. 30 € pro 6-well-Multiplatte

 

Anwendungsbeispiele

Untersuchungen zum Einfluss von Flavonoiden, NO oder Ascorbinsäure auf apoptotische Vorgänge an Darmzellen (Kuntz et al. 1999 und Wenzel et al. 2003) sowie Einfluss von Milcholigosacchariden auf die Entwicklung von Darmzellen (Kuntz et al. 2007)


Referenzen

  1. Sakahira H, Enari M, Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature 1998;391:96-9.
  2. Nicholson DW, Ali A, Thomberry NA, et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature 1995;376:37-43.
  3. Kuntz S, Wenzel U, Daniel H. Comparative analysis of the effects of flavonoids on proliferation, cytotoxicity, and apoptosis in human colon cancer cell lines. Eur J Nutr. 1999;38(3):133-42.
  4. Wenzel U, Kuntz S, De Sousa UJ, Daniel H. Nitric oxide suppresses apoptosis in human colon cancer cells by scavenging mitochondrial superoxide anions. Int J Cancer. 2003;106(5):666-75.
  5. Kuntz S, Rudloff S, Kunz C. Oligosaccharides from human milk influence growth-related characteristics of intestinally transformed and non-transformed intestinal cells. Br J Nutr. 2007;10:1-10.