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Bestimmung von Superoxidanionen

Die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in aerob lebenden Organismen wird in sehr engen Grenzen kontrolliert. Entfällt diese Kontrolle kommt es zum oxidativen Stress und ihre Bildung nimmt dramatisch zu.

 

Prinzip

Mit der Zunahme der ROS kommt es zu Veränderungen von Molekülen (Lipide, Proteine und Nukleinsäuren),

Abbildung 4.10.2
Generation of superoxide anions in dependency of time. Intestinal cells were loaded with MitoSOX Red reagent and finally incubated for 30 min with the test compunds. The increase of the fluorescence as a result of oxidation of MitoSOX Red can be detected
die ihre physiologische Funktion anschließend nicht mehr erfüllen können. Diese oxidativen Schäden werden im Zusammenhang mit Alterungsprozessen, entzündlichen Erkrankungen und Krebserkrankungen diskutiert. Um die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies in lebenden Zellen zu bestimmen, kann der hoch selektive Marker MitoSOXTM im Zellsystem verwendet werden. Mitochondrien stellen die Hauptquelle der in der Zelle generierten reaktiven Sauerstoffspezies dar. MitoSOX™ diffundiert in das Mitochondrium und wird anschließend durch die gebildeten Superoxide oxidiert. Nach der Oxidation kann das Oxidationsprodukt an Nucleinsäuren binden und es entsteht eine rote Fluoreszenz, die fluorimetrisch in Echtzeit erfasst werden kann. Das MitoSOX™ Red-Reagenz wird spezifisch von Superoxiden oxidiert und nicht von anderen ROS- oder reaktiven Stickstoff (RNS)-generierenden Systemen. Als Nachweis für die Spezifität kann die Gabe von Superoxiddismutase verwendet werden, welches die Oxidation des MitoSOX™ Red-Reagenz inhibiert (Mukhopadhyay et al. 2007).

 

Versuchsauswertung

  1. Nach Vorinkubation des MitoSOXTM Red-Reagenz erfolgt die Zugabe der zu testenden Substanz (Positivkontrolle).
  2. Anschließend wird in Echtzeit die Zunahme des Oxidationsproduktes im Mikroplattenreader fluorimetrisch erfasst und in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt.

 

Abbildung oben.

 

 

Kosten

  • Kosten für die Detektion der Superoxidanionen: 130 € / 24 well-Platte.
  • Dieser Preis kann in Abhängigkeit vom Zellmaterial abweichen. Preis auf Anfrage

 

Anwendungsbeispiele

Detektion des oxidativen Stresses in lebenden Zellen von nutritiven Stressoren in physiologischen oder pharmakologischen Konzentrationen (Kulich et al. 2007; Fauconnier et al. 2007).

  

Referenzen

  1. Mukhopadhyay P,  Rajesh P, Yoshihiro K, Haskó G and Pacher P. Simple quantitative detection of mitochondrial superoxide production in live cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007;358(1):203-8.
  2. Kulich SM, Horbinski C, Patel M, Chu CT.6-Hydroxydopamine induces mitochondrial ERK activation. Free Radic Biol Med. 2007 1;43(3):372-83.
  3. Fauconnier J, Andersson DC, Zhang SJ, Lanner JT, Wibom R, Katz A, Bruton JD, Westerblad H. Effects of palmitate on Ca(2+) handling in adult control and ob/ob cardiomyocytes: impact of mitochondrial reactive oxygen species. Diabetes. 2007;56(4):1136-42. Epub 2007 Jan 17.