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Zelladhäsion

Leukozyten wie neutrophile Granulozyten spielen eine zentrale Rolle bei der akuten Entzündungsreaktion, die mit einer Einwanderung dieser Zellen in das betroffene Gewebe einhergeht.

 

Prinzip des Durchflussmodells

Die Rekrutierung und Aktivierung dieser Leukozyten ist ein mehrstufiger Vorgang, der u.a. das Rolling,

Abbildung 4.6.1.1
(A) Preparation of HUVEC obtained from umbilical cord veins; (B) flow chamber and perfusion system as well as (C) video documentation of adherent cells using the flow model.
die feste Adhäsion der Leukozyten an das Endothel, die transendotheliale Diapedese sowie die chemotaktisch gesteuerte Migration zum Entzündungsort umfasst.

Die endothelialen und leukozytären Adhäsionsmoleküle der Selektin- und Integrinfamilie (z.B. E-, P- bzw. L-Selektin und LFA-1 (CD11a/CD18), VCAM, ICAM) sind für die Extravasation von neutrophilen Granulozyten im Rahmen inflammatorischer Prozesse essentiell, da sie die oben angesprochenen Zelladhäsionsvorgänge vermitteln.

Im Rahmen eines In-Vitro-Modells zur Untersuchung der Adhäsion und des Rollings werden zunächst Endothelzellen (HUVEC-Zellen) auf Objektträgern kultiviert. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen in eine Flow-Kammer eingesetzt und die Leukozyten mit einer Perfusionspumpe über die Endothelzellen geleitet, wobei die intravasalen Scherkräfte berechnet und eingestellt werden können. 

Abbildung oben links.

 

 

Prinzip des statischen Modells

Im Rahmen eines In-Vitro-Modells zur Untersuchung der Adhäsion werden zunächst wie im Flow-Modell Endothelzellen (HUVEC-Zellen) auf Multiwellplatten kultiviert. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen mit den entsprechenden Aktivatoren stimuliert und mit vorher angefärbten mononukleären Zellen (T-Lymphozyten) inkubiert und anschließend die Intensität der Färbung fluorimetrisch gemessen, die proportional zur den adhärenten Zellen ist.

Zur Anfärbung der mononukleären Zellen wird der Farbstoff Calcein-AM verwendet. Dieser nicht-fluoreszierende Farbstoff penetriert die zelluläre Membran und wird intrazellulär durch unspezifische Esterasen gespalten und es entsteht das fluorogene nicht-permeable Calcein. Calcein, auch bekannt unter dem Namen Fluorexon, ist ein Fluorescein-Derivat und hat sein Anregungsmaximum bei 495nm (Excitation) und sein Abstrahlungsmaximum (Emission) bei 515nm und kann somit quantitativ im Fluoroscan-Reader erfasst werden.

 

Versuchsauswertung

Mittels videogestützter Dokumentation werden im Rahmen des Durchflussmodelles Bilderserien ausgewertet und die Anheftung der mononukleären Zellen pro Bildeinheit erfasst. 

 

Abbildung oben rechts. 

 

Kosten für Flow-Modell

  • Ca. 100 € pro 4-well Multiplatte

Kosten für statisches Modell

  • Ca. 150 € pro 24-well Multiplatte 

 

Anwendungsbeispiel

Einfluss von Milcholigosacchariden auf die Adhäsion von Leukozyten an humane Endothelzellen (Bode et al. 2004a,b und Reiss et al. 2004)

 

Referenzen

  1. Bode L, Kunz C, Muhly-Reinholz M, Mayer K, Seeger W, Rudloff S. Inhibition of monocyte, lymphocyte, and neutrophil adhesion to endothelial cells by human milk oligosaccharides. Thromb Haemost. 2004a;92:1402-10.
  2. Bode L, Rudloff S, Kunz C, Strobel S, Klein N. Human milk oligosaccharides reduce platelet-neutrophil complex formation leading to a decrease in neutrophil beta 2 integrin expression. J Leukoc Biol. 2004b;76(4):820-6.
  3. Reiss I, Kuntz S, Schmidt R, Kunz C, Gortner L, Rudloff S. Effect of pulmonary surfactant on TNF-alpha-activated endothelial cells and neutrophil adhesion in vitro. Immunobiology. 2004;209:235-44.