GPCRs und Neuropeptide
Auch wenn die weitaus größere Zahl an paarungsabhängig exprimierten Genen im Weibchen auftritt, werden auch beim Männchen Gene paarungsabhängig reguliert1,2.
Unter den differentiell exprimierten Genen befinden sich G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), von denen viele in Männchen und ungepaarten Weibchen exprimiert sind, aber unabhängig von den Gonaden3. Überraschenderweise werden diese GPCRs nach Paarung im Weibchen herunter reguliert3,4. Uns interessiert die Gonaden-unabhängige aber paarungsbeeinflusste Rolle dieser GPCRs. Prinzipiell vermittelt diese Rezeptorklasse die Weiterleitung extrazellulärer Signale in das Innere der Zelle. Die Aktivierung von GPCRs geschieht über die Bindung spezifischer Liganden an die extrazelluläre Domäne. Entsprechende Liganden gehören zu vielfältigen Gruppen, darunter Hormone, Neurotransmitter und Peptidhormone. Aktivierte GPCRs regulieren unter anderem Zellwachstum und -differenzierung. Um die biologische Funktionsweise und Bedeutung von GPCRs zu verstehen, ist es essentiell, den/die passenden Liganden zu identifizieren. Das versteht man auch unter einer „Deorphanisierung“ von GPCRs.
Ziel dieses Projekts ist die Deorphanisierung ausgewählter GPCRs aus S. mansoni sowie die Entschlüsselung von Signalwegen, die durch diese Rezeptoren aktiviert werden. Im Fokus stehen dabei solche GPCRs, die durch Peptidhormone gebunden werden. In einem ersten Schritt zur Aufschlüsselung von Peptidhormon-GPCR-Interaktionen verwenden wir das Hefe-2-Hybrid-System (Yeast-two-hybrid, Y2H). Ursprünglich diente es dazu, Wechselwirkungen von intrazellulären Proteinen nachzuweisen. Durch Weiterentwicklung und Anpassung an neue Herausforderungen ist es jedoch gelungen, das Y2H-System so zu modifizieren, dass auch Interaktionen von extrazellulären Liganden mit membrangebundenen Rezeptoren nachgewiesen werden können (Fig. 1)5,6
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Fig 1: Schematische Darstellung des Y2H-Systems. Interagiert ein Ligand mit dem dazugehörigen Rezeptor, kommen die beiden Ubiquitinhälften (Cub & NubG) als „anklonierte" Bestandteile von GPCRs in eine räumliche Nähe zueinander. Durch einen enzymatischen Abbau wird der Transkriptionsfaktor GAL4 freigesetzt und gelangt in den Zellkern. Dort werden Reportergene aktiviert, die eine Selektion auf Interaktion erlauben3,4. |
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Um die Funktionsweise von GPCRs besser zu verstehen, werden im Rahmen dieses Projekts ausgewählte GPCRs und bindende Neuropeptide durch RNA Interferenz (RNAi) in S. mansoni in vitro herunterreguliert. Anschließend sollen Analysen der Entwicklung, Morphologie, Eiproduktion, Beweglichkeit oder Paarungsstabilität der Würmer Rückschlüsse auf die Funktion entsprechender GPCRs und Liganden liefern. Ein weiterer Baustein der Charakterisierung wird durch die räumliche Darstellung des Transkriptaufkommens erreicht. So werden Transkripte von GPCR- und Neuropeptid-Genen durch Whole-mount In Situ Hybridisierung (WISH) aufgedeckt, eine im Labor von Prof. Jim Collins (Texas University) optimierte Methode, die es erlaubt, RNA-Moleküle in ganzen Würmern sichtbar zu machen (Fig. 2)7,8
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Fig 2: Beispielhafte Darstellung des räumlichen Verteilungsmusters von Transkripten eines Hormonpeptid-kodierenden Gens. Zu sehen sind ein männlicher (♂) und ein weiblicher (♀) Wurm der Spezies S. mansoni. Eine spezifische RNA-Sonde wurde verwendet, um Neuropeptid-Transkripte mittels WISH sichtbar zu machen. Wie in beiden Exemplaren zu sehen, werden spezifische Strukturen angefärbt, die vom Verteilungsmuster her auf das Nervensystem schließen lassen. |
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1Lu Z, Sessler F, Holroyd N, Hahnel S, Quack T, Berriman M and Grevelding CG (2016) Schistosome sex matters: a deep view into gonad-specific and pairing-dependent transcriptomes reveals a complex gender interplay. Sci Rep. 6:31150.
2Lu Z, Sessler F, Holroyd N, Hahnel S, Quack T, Berriman M, Grevelding CG (2017) A gene expression atlas of adult Schistosoma mansoni and their gonads. Sci Data. 4:170118.
3Hahnel S, Wheeler N, Lu Z, Wangwiwatsin A, McVeigh P, Maule A, Berriman M, Day T, Ribeiro P and Grevelding CG (2018) Tissue-specific transcriptome analyses provide new insights into GPCR signalling in adult Schistosoma mansoni. PLoS Pathog. 14:e1006718.
4Lu Z, Spänig S, Weth O, Grevelding CG (2019) Males, the wrongly neglected partners of the biologically unprecedented male-female interaction of schistosomes. Front Genet. 10:796.
5Li J, Gao J, Han L, Zhang Y, Guan W, Zhou L, Yu Y and Han W (2016) Development of a membrane-anchored ligand and receptor yeast two-hybrid system for ligand-receptor interaction identification. Sci Rep. 6:35631.
6Weth O, Haeberlein S, Haimann M, Zhang Y and Grevelding CG (2019) Towards deorphanizing G protein-coupled receptors of Schistosoma mansoni using the MALAR yeast two-hybrid system. Parasitology 147(8), 865-873
7Cogswell AA, Collins JJ 3rd, Newmark PA, Williams DL (2011) Whole mount in situ hybridization methodology for Schistosoma mansoni. Mol Biochem Parasitol. 178(1-2):46-50.
8Collins JN, Collins JJ 3rd(2017) Methods for studying the germline of the human parasite Schistosoma mansoni. Methods Mol Biol. 1463:35-47.