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Real-time PCR

Die Real-time PCR stellt ein schnelles und vollautomatisiertes Verfahren zur Quantifizierung der Genexpression (mRNA-Expression) dar. In einem Schritt findet kombiniert die Amplifikation, PCR-Produkt-Detektion und –Quantifizierung statt.

 

Prinzip

Die Methode erlaubt die direkte Detektion der PCR-Produkt-Akkumulation über Fluoreszenzfarbstoffe oder

Abbildung 4.9.1
Principle of quantitative real-time PCR. Increased fluorescence in dependency of differnet cDNA concentraions. Threshold (CT) is the level of fluorescence above the baseline, at which the signal can be considered not to be background. It is defined as the
Fluoreszenzfarbstoff-markierte Sonden. Das Signal der durch eine Lichtquelle angeregten Fluoreszenzfarbstoffe korreliert dabei quantitativ mit der Menge an PCR-Produkt und kann in Echtzeit (Real-time) dargestellt werden. Hierbei können verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe und Sonden zum Einsatz kommen: SYBR Green ist ein nicht-gekoppelter Fluoreszenzfarbstoff und bindet generell an jede doppelsträngige DNA. Bei den sog. TaqMan-Sonden handelt es sich hingegen um für die Ziel-DNA sequenz-spezifische Oligonukleotide, die mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt sind. Diese TaqMan-Sonden sind mit zwei Farbstoffen markiert, einem fluoreszierenden Reporterfarbstoffe (z.B: FAM) und einem "Quencher" (z.B. TAMRA). Sobald die Sonde an die Zielsequenz bindet, wird durch die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der Polymerase die Sonde hydrolysiert und somit eine steigende Reporter-Fluoreszenz gemessen. Je mehr Amplifikate entstehen, umso stärker wird das Signal des fluoreszierenden Reporterfarbstoffs (Hugget et al. 2005 und Nolan et al. 2006).

In der Abbildung oben links  ist beispielhaft die Amplifikationskurve mit unterschiedlichen cDNA Konzentrationen dargestellt.

 

 

Versuchsauswertung

Die Ergebnisse jeder quantitativen RT-PCR Methode, so auch der Real-time PCR, werden durch RT-PCR spezifische Störfaktoren beeinflusst und führen zu einer Missinterpretation der ermittelten Expressionsprofile. Für eine Quantifizierung ist daher eine Korrektur dieser Faktoren notwendig. Die derzeit am besten akzeptierte Methode ist dabei die Normalisierung der Expression des Zielgens zur Expression eines Referenzgens. Das heißt, in derselben Probe wird die Expression des Ziel-Gens und des Referenzgens parallel erfasst und die ermittelten Werte des Zielgens relativ zu dieser internen Kontrolle angegeben.

Die Berechnung des Expressionsunterschiedes erfolgt über die sog. DDCΤ-Methode. Für jede untersuchte Probe wird der CΤ-Wert des Referenzgens vom CΤ-Wert des Zielgens abgezogen. Anschließend wird das DDCΤ-Berechnungsmodell durchgeführt, indem vom DCΤ-Wert der behandelten Proben der DCΤ-Wert der Kontrolle abgezogen wird. Aus der arithmetischen Formel 2-DDCΤ ergibt sich der relative Expressionsunterschied der Probe zwischen der Behandlung und der Kontrolle, normalisiert auf das Referenzgen und auf eine Standardprobe bezogen. 

 

Abbildung oben rechts. 

 

 

Kosten

  • Kosten für die Real-time PCR ca. 300 € pro 100 Proben
  • Bei Aufarbeitung der Proben und reverser Transkription kann der Preis variieren. Preis auf Anfrage

 

Anwendungsbeispiele (allgemein)

Regulatorischer Einfluss von Nahrungsinhaltsstoffen auf die Genexpression wie z. B. den Einfluss von Milchpeptiden und –oligosacchariden auf die Genexpression von Zellzyklusassoziierten Genen (Kuntz et al. 2009) sowie den Einfluss von Glycotoxinen auf die Expression pro-inflammatorischer Gene (Kuntz et al. 2009).

 

Referenzen

  1. Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immun. 2005 Jun;6(4):279-84
  2. Nolan T, Hands R and Bustin S; Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.  NATURE PROTOCOLS(2006) Jun; 12(12):1559-1569
  3. Kuntz S, Kunz C, Rudloff S. Oligosaccharides from human milk induce growth arrest via G2/M by influencing growth-related cell cycle genes in intestinal epithelial cells. Br J Nutr. 2009 May;101(9):1306-15.
  4. Kuntz S, Rudloff S, Ehl J, Bretzel RG, Kunz C.Food derived carbonyl compounds affect basal and stimulated secretion of interleukin-6 and -8 in Caco-2 cells. Eur J Nutr. 2009 Jun 21. [Epub ahead of print]