Benutzerspezifische Werkzeuge

Information zum Seitenaufbau und Sprungmarken fuer Screenreader-Benutzer: Ganz oben links auf jeder Seite befindet sich das Logo der JLU, verlinkt mit der Startseite. Neben dem Logo kann sich rechts daneben das Bannerbild anschließen. Rechts daneben kann sich ein weiteres Bild/Schriftzug befinden. Es folgt die Suche. Unterhalb dieser oberen Leiste schliesst sich die Hauptnavigation an. Unterhalb der Hauptnavigation befindet sich der Inhaltsbereich. Die Feinnavigation findet sich - sofern vorhanden - in der linken Spalte. In der rechten Spalte finden Sie ueblicherweise Kontaktdaten. Als Abschluss der Seite findet sich die Brotkrumennavigation und im Fussbereich Links zu Barrierefreiheit, Impressum, Hilfe und das Login fuer Redakteure. Barrierefreiheit JLU - Logo, Link zur Startseite der JLU-Gießen Direkt zur Navigation vertikale linke Navigationsleiste vor Sie sind hier Direkt zum Inhalt vor rechter Kolumne mit zusaetzlichen Informationen vor Suche vor Fußbereich mit Impressum

Artikelaktionen

Identifizierung von Proteinen mit Kinaseaktivität

Eine Vielzahl externer Stimuli wie Wachstumsfaktoren, Hormone oder auch Stress können über die Aktivierung membranständiger Rezeptoren Signalkaskaden induzieren, welche zelluläre Vorgänge wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose beeinflussen.

 

Prinzip

Human Phospho-MAPK Array und -RTK Array zur Bestimmung relativer Phosphorylierungsspiegel aktiverter Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs), Tyrosin-Kinasen (RTK) und anderer Serin/Threonin-Kinasen

Unter den intrazellulären Signaltransduktionskaskaden nehmen die Kinasen der Mitogen-aktivierten

Abbildung 4.8.3
Human Phospho–MAPK array kit for detection of multiple phosphorylated kinases in treated as well as untreated cells.

Proteinkinase-Familie (MAPK) eine zentrale Rolle ein. Die MAPK-Familie vereint eine Reihe von Serin/Threonin-Kinasen, wie z.B. ERK-1 (p44MAPK), ERK-2 (p42MAPK), Jun N-terminale Kinasen und p38-MAPK. Eine Stimulation der Zelle durch z.B. mitogene Faktoren führt in der Regel zu einer Erhöhung der MAP-Kinase-Aktivität. ERK-1 und -2 z.B. translocieren daraufhin in den Zellkern und aktivieren Transkriptionsfaktoren, was nachfolgend zur Zellproliferation oder Zelldifferenzierung führt, während eine Hemmung der MAPK diese Vorgänge inhibiert. Bei konstitutiver Aktivierung dieser Kinasen kann es zum unkontrollierten Zellwachstum kommen, was eine wichtige Rolle in der Tumorgenese spielt. Ebenso wird eine erhöhte ERK-Aktivität mit erhöhtem Potenzial der Tumoren für Invasivität und Metastasenbildung in Verbindung gebracht.

Die Aktivierung dieser Kinasen kann durch diverse Rezeptorliganden erfolgen, wobei der Rezeptor-Tyrosinkinase-vermittelte Mechanismus der ERK1/2-Aktivierung gut charakterisiert ist. Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK) sind wichtige Mediatoren physiologischer Zellvorgänge wie Proliferation, Differenzierung, Motilität oder Regulation des Zellüberlebens. Zu den RTK gehört u.a. der Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und der Insulinrezeptor. Bei Bindung eines Rezeptorliganden an die spezifische Bindungsstelle des RTK kommt es zu einer Konformationsänderung und nachfolgender Dimerisierung des Rezeptors. Dies führt zu einer Transphosphorylierung der beiden Monomere. Phosphorylierte Tyrosinreste des aktivierten Rezeptors bilden eine Andockstelle für Adapterproteine, welche dann in der Lage sind, dadurch eine Proteinkinase-Kaskade zu initiieren. Dieses Prinzip ist auch bei anderen Rezeptor-Tyrosinkinasen zu beobachten.

Mit Hilfe des Human Phospho-MAPK Arrays und des Human Phospho-RTK Arrays kann der Phosphorylierungsstatus einer Vielzahl von Signalmolekülen wie auch die Rezeptor-phosphorylierung im Signaltransduktionspozess gemessen werden. Der Vorteil dieser Arrays ist die Vielzahl der erfassten MAP-Kinasen und RTK:

 

Erfasste MAPK (21 MAPK):

ERK1 , ERK2, JNK1, JNK2, JNK3, JNK-pan, p38-α , p38-b, p38-g, p38d ,RSK1, RSK2, GSK-3a, GSK-3b, Akt1, Akt3, Akt2, Akt pan, MSK1, MSK2 , HSP27, p70 S6 Kinase

 

Erfasste RTK (42 RTK):

EGFR, ErbB2, -3, -4, FGFR1, -2a, -3, -4, InsulinR, IGF1-R, Axl, Dtk, Mer, HGFR, MSPR, PDGFRa, -ß, SCFR, Flt-3, MCDFR, c-Ret, ROR1, -2, Tie-1, -2, TekA, -B, -C, VEGFR1, -2, -3, MuSK, Epha1-7, EphB1-6

 

Prinzip der Messung

Die Kinase-spezifischen Antikörper sind auf einer Nitrozellulosemembran als Dubletten gespottet und werden mit dem präpariertem Zelllysat inkubiert, wobei eine Bindung der phsophorylierten Kinasen an die gespotteten Antikörper erfolgt. Zum Nachweis wird ein „Cocktail“ aus Antikörpern gegen die 21 spezifischen Kinasen, an deren Ende Biotin gekoppelt ist, auf jeden Spot pipettiert. Es entsteht pro Spot nun eine mehrschichtige Lage von immobilisierten Antikörpern, Kinase und dem Antikörper-Biotin-Komplex in Form eines „molekularen Sandwichs“. Die eigentliche Nachweisreaktion erfolgt anschließend durch Zugabe von Streptavidin-HRP und der Erfassung der Chemilumineszenz.

 

 

 Versuchsauswertung

Die Zellen wurden 15 min mit dem Substrat behandelt oder blieben unbehandelt. Nach Präparation des Zelllysates, der Inkubation mit den Antikörpern erfolgt der Nachweis mittels Chemolumineszenz. Die digitalisierten Bilder werden anschließend densitometrisch ausgewertet und die Pixel-Intensität graphisch dargestellt.

Abbildung oben.

 

Kosten

  •  

    Ca. 380 € für 4 Proben zur simultanen Bestimmung von 21 MAPK

     

  •  

    Ca. 450 € für 4 Proben zur simultanen Bestimmung von 42 RTK

     

     

 

Anwendungsbeispiel (allgemein)

Regulatorischer Einfluss von Nahrungsinhaltsstoffen auf die Phosphorylierung von Signalproteinen bzw. Rezeptoren im Rahmen der Immunantwort (Wang et al. 2007 und Stehphen et al. 2007) sowie der Einfluss von Milcholigosacchariden auf die Signaltransdukitonsprozesse (Kuntz et al. 2009).

 

 

Referenzen

  1. Wang N et al. Self-renewal of human embryonic stem cells requires insulin-like growth factor-1 receptor and ERBB2 receptor signaling. Blood 2007;10:1182-86.
  2. Stephen G, Ball C, Shuttleworth A and Kielty CM. Vascular endothelial growth factor can signal through platelet-derived growth factor receptor. Journal of Cell Biol. 2007;177:489–500.
  3. Kuntz S, Kunz C, Rudloff S. Oligosaccharides from human milk induce growth arrest via G2/M by influencing growth-related cell cycle genes in intestinal epithelial cells. Br J Nutr. 2009;101(9):1306-15.