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Charakterisierung von Enzymen zur Wirkstoffentwicklung

Dieses Projekt stellt die Analyse cytosolischer Kinasen (SmAbl1, SmAbl2, SmTK6)1,2, zweier Aldehyddehydrogenasen (SmALDH1 & 2) sowie der Aldosereduktase (SmAR) von Schistosoma mansoni in den Mittelpunkt. SmAR und SmALDHs scheinen bei der antioxidativen Abwehr eine Rolle zu spielen, während Kinasen bei Differenzierungsprozessen, besonders in Weibchen, sowie der Entwicklung der Gonaden beteiligt sind3. Ziel der Arbeit ist es, diese Enzyme zu charakterisieren und als geeignete Zielstrukturen für chemische Substanzen oder deren Derivate zu validieren4,5. Dazu werden die ausgewählten Gene  kloniert und anschließend in E. coli oder anderen Systemen exprimiert (Fig. 1).7

Durch Aktivitätsassays wird die Funktion dieser Enzyme näher charakterisiert (Fig. 2). Die Lokalisierung der Transkripte der entsprechenden Gene wird mittels in-situ-Hybridisierung in adulten Schistosomen durchgeführt und die Funktionsanalyse über RNA-Interferenz. Daneben werden verschiedene, bereits bekannte Inhibitoren dieser Enzyme auf ihre Wirksamkeit gegen Schistosomula sowie adulte Schistosomen in der in vitro-Kultur bzw. am exprimierten Enzym überprüft. Zudem sollen die Enzyme kristallisiert werden, um nach erfolgreicher Aufklärung ihrer Strukturen computergestützt nach weiteren interagierenden Substanzen zu suchen. Diese Arbeit soll Hinweise darauf liefern, welches dieser Moleküle ein besonders gutes Ziel darstellt, und welche der zu testenden Substanzen potenziell als Grundlage einer Weiterentwicklung zu neuen Wirkstoffen gegen Schistosomiasis dienen könnte.

 

Fig. 1: Proteinexpression und Reinigung der SmALDH_2Während der Proteinexpression und Reinigung wurden jeweils Proben per SDS-PAGE analysiert. Die Proteinexpression wurde in E. coli durch Zugabe von 200 µM IPTG induziert und die Kultur für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das mit His-Tag exprimierte Protein (durch den Pfeil gekennzeichnet) wurde mit Ni-NTA Kügelchen gereinigt und durch eine ansteigende Imidazol-Konzentration eluiert. M - Größenstandard 0 - vor der Induktion der Proteinexpression, 4 – 4 Stunden nach der Induktion der Proteinexpression, P – lysiertes Pellet, L – Lysat, NB – Durchflussfraktion, W – Waschfraktion.

Fig. 2 Aktivitätsassay für SmALDH_2Die Aktivität von SmALDH_2 beruht auf der Umsetzung des Substrats Acetaldehyde zu Essigsäure. Während dieser Reaktion wird NAD+ zu NADH reduziert, dessen Konzentrationsanstieg bei 340 nm gemessen wird. Das Enzym ist nur durch Zugabe eines Reduktionsmittels aktiv.

 

 

1Beckmann S, Grevelding CG (2010) Imatinib makes a fatal impact on morphology, pairing stability, and survival of adult S. mansoni in vitro. Int J Parasitol. 40, 521-26.

2Beckmann, S., Hahnel, S., Dissous, C., Cailliau, K., Browaeys, E., Grevelding, C.G. (2011) Characterization of the Src/Abl hybrid-kinase SmTK6 of Schistosoma mansoni. J Biol Chem. 286, 42325-42336.

3Grevelding, C.G., Langner, S., Dissous, C. (2018) Kinases: molecular stage directors for schistosome development and differentiation. Trends Parasitol. 34(3), 246-260.

4Dissous C, Grevelding CG (2011) Piggy-backing cancer drugs for schistosomiasis treatment, a tangible perspective? Trends Parasitol. 27, 59-66.

5Gelmedin, V., Dissous, C., Grevelding, C.G. (2015) Re-positioning protein kinase inhibitors against schistosomiasis. Fut Med Chem. 7(6), 737-752.