DFG-Sachbeihilfe KR1143/13-1 "Regulierung von Virus-Wirt Membrankontaktstellen während der Bildung replikativer Organellen und der Endomembran Remodellierung in Coronavirus-infizierten Zellen" / "Regulation of virus-host membrane contact sites during replication organelle formation and endomembrane remodeling in coronavirus-infected cells"

Kurzbeschreibung:

Coronaviren (CoV) sind für zentrale Schritte ihres Replikationszyklus auf Wirtszellmembranen angewiesen, indem sie größtenteils dem endoplasmatischen Retikulum entstammende sogenannte replikative Organellen (ROs) induzieren. Dieser Prozess stört intrinsische zelluläre Überwachungs- und Signalmechanismen und ist unvollständig verstanden.

Der vorliegende Antrag konzentriert sich auf Membrankontaktstellen (MCS), dynamische Kontaktpunkte zwischen Organellen, die zentrale Prozesse wie Signalübertragung, Membrandynamik und Organellenbiogenese mittels spezialisierter MCS-Tethering-Komplexe koordinieren.

Veröffentlichte und unveröffentlichte Daten der Antragsteller legen nahe, dass in infizierten Zellen lipidgesteuerte MCS zwischen nsp3/nsp4, den beiden für die RO-Bildung wesentlichen CoV-Proteinen, und verschiedenen Organellen entstehen.

Weitere Ergebnisse implizieren spezifische Phosphoinositide, eine Klasse modifizierter Lipide, die zur MCS-Bildung beitragen kann, in die CoV-Replikation. Hierbei reduziert die pharmakologische und genetische Hemmung nicht-kanonischer Phosphoinositidkinasen die Bildung und das Wachstum von ROs. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass mehrere Ebenen der MCS-Regulation zur RO-Biogenese beitragen.

Vor diesem Hintergrund bündeln die beiden Antragsteller ihre komplementäre Expertise in der CoV-Biologie und reversen Genetik, molekularer Bildgebung, CRISPR-Cas9-Technologie und Proteomik/Bioinformatik, um ihre zentrale Hypothese zu überprüfen, der zufolge CoVs spezifische, an MCS-Bildung und dem Umbau von Endomembranen beteiligte Phosphoinositid-Lipid-Signale, Proteininteraktionen und Signalwege regulieren.

Zunächst sollen mit Hilfe unvoreingenommener, mehrstufiger Proteomikverfahren sowohl in minimalen nsp3/nsp4-exprimierenden Systemen als auch in mit genetisch veränderten CoV-Mutanten infizierten Zellen MCS Komponenten identifiziert werden, die ROs mit zellulären Organellen verbinden.

Nachfolgend werden die neu identifizierten Regulatoren der MCS-Bildung mittels proximitätsbasierter molekularer Bildgebung und funktionellen Assays in infizierten Zellen systematisch validiert.

Ergänzend werden systematisch die subzelluläre Lokalisation von ausgewählten Phosphoinositiden und die Rolle der dabei beteiligten (nicht)kanonischen Lipidkinasen im Kontext der MCS- und RO-Bildung erfasst.

Bioinformatische Meta-Analysen der im Rahmen dieser Arbeit generierten großen Datensätze, werden genutzt, um kanonische, nicht-kanonische und konservierte MCS in Zellen zu kartieren, die mit genetisch unterschiedlichen CoVs infiziert sind, mit dem übergeordneten Ziel, ein besseres Verständnis der virusinduzierten MCS zu erlangen.

Langfristig wird dieses Projekt nicht nur wichtige neue Erkenntnisse darüber liefern, wie CoV die zelluläre Architektur zu ihrem Vorteil umgestalten, sondern auch dazu beitragen, neue zentrale Schalter zu identifizieren, die für künftige antivirale Interventionen geeignet sind.

Short Summary:

Coronaviruses (CoV) rely on host cell membranes for most steps of their replication cycle. CoVs induce so-called replication organelles (ROs) that mainly originate from the endoplasmic reticulum. This process interferes with intrinsic cellular surveillance and signaling mechanisms and is incompletely understood.

The present proposal will focus on mechanisms involving membrane contact sites (MCSs). MCSs are dynamic junctions that orchestrate key processes such as signaling, membrane dynamics, and organelle biogenesis through specialized MCS tethering complexes to physically bridge two organelles.

Published and unpublished data obtained by the applicants strongly support the idea that, in CoV-infected cells, lipid-driven MCS are formed between nsp3/nsp4 (i.e., the two CoV proteins that induce RO formation) and different organelles.

Additional data imply a role of certain phosphoinositides in CoV replication, a class of modified lipids suggested to coordinate factors essential for MCS formation. Specifically, we found that pharmacological and genetic inhibition of non-canonical phosphoinositide kinases reduces the formation and growth of ROs. Collectively, these findings indicate that several layers of MCS regulation contribute to RO biogenesis.

Against this background, the two applicants will combine their complementary expertise in CoV biology and reverse genetics, molecular imaging, CRISPR-Cas9 technology and proteomics / bioinformatics to evaluate their main hypothesis according to which CoVs regulate specific phosphoinositide lipid signals as well as critical protein interactions and pathways involved in MCS formation and endomembrane remodeling.

Initially, they will combine unbiased multi-level proteomics approaches to identify MCS tethers connecting ROs and cellular organelles in a minimal nsp3/nsp4-driven RO formation system and in cells infected with genetically engineered CoV mutants.

Subsequently, they will systematically validate key factors of MCS formation by proximity-based molecular imaging and functional assays in infected cells.

In addition, the subcellular localization of selected phosphoinositides and the role of the involved (non)canonical lipid kinases in the context of MCS and RO formation will be systematically investigated.

Bioinformatic meta-analyses of the large data sets generated during this work will be employed to define canonical, non-canonical and conserved MCS landscapes in cells infected with genetically diverged CoVs with the overarching goal to gain a better understanding of virus-induced MCSs.

In the long term, this project will not only provide important new insights into how CoV remodel cell architecture to their advantage, but may also help to identify new hubs suitable for future antiviral interventions.