KFO 309 KR1143/9-2 "Virus-induced Lung Injury: Pathobiology and Novel Therapeutic Strategies", Teilprojekt P3

Kurzbeschreibung:

Coronaviren (CoV) sind wichtige Erreger humaner respiratorischer Erkrankungen, wobei es zwischen Infektionen mit gängigen humanen CoV (z.B. HCoV-229E) und zoonotischen CoV (z.B. MERS-CoV) erhebliche Unterschiede im Schweregrad des Krankheitsbildes gibt, deren molekulare Grundlagen nur unzureichend verstanden sind. In diesem Projekt sollen die CoV-regulierten Signalpfade und Moleküle sowie deren Interaktionen mit CoV-kodierten Effektor-Proteinen in der Lunge untersucht werden, um daraus neue therapeutische Strategien zur effektiveren Behandlung von CoV-Infektionen entwickeln zu können. Durch Verwendung geeigneter, technisch anspruchsvoller Methoden (In-vitro-Kultursysteme menschlicher Lungenzellen, reverse CoV-Genetik, Transkriptomik, Einzelzell-mRNA- und Protein-Interaktions-Assays) konnten wir in der vergangenen Förderperiode nachweisen, dass HCoV-229E eine massive, genomweite Wirtszellantwort über NF-κB-abhängige und unabhängige Signalwege hervorruft, die sich von klassischen inflammatorischen Zytokinantworten unterscheidet. CoV modulieren das NF-κB-System und die Unfolded Protein Response (UPR) in einer einzigartigen, virusspezifischen Weise, was durch weitere Studien mit NF-κB- oder UPR-spezifischen Inhibitoren zusätzliche Unterstützung fand. Untersuchungen des Lipidoms CoV-infizierter Zellen und Inhibitorstudien lieferten Hinweise auf eine besondere Rolle von spezifischen Lysophospholipiden bei der Ausbildung der für die virale RNA-Synthese benötigten intrazellulären Membranstrukturen. Außerdem charakterisierten wir CoV-kodierte Enzyme, die die antivirale Wirtsantwort beeinflussen, und konnten dabei u.a. zeigen, dass das akzessorische Protein ap4 von HCoV-229E spezifische Signalwege in der Wirtszelle moduliert. Arbeiten der nächsten Förderperiode werden sich darauf richten, Interaktionen spezifischer CoV-Proteine mit zellulären Signalwegen zu charakterisieren unter Verwendung geeigneter HCoV-229E- und MERS-CoV-Mutanten mit Mutationen in nichtessentiellen Genen (Ziel 1). Weiterhin planen wir eine systematische Analyse Virus- und Zelltyp-spezifischer Unterschiede unter Verwendung spezifischer humaner Lungenzelltypen, die mit HCoV-229E- bzw. MERS-CoV infiziert werden (virale Replikation; virale und zelluläre Genexpression; Zelltropismus) (Ziel 2). Potentielle Unterschiede auf der Ebene der Signaltransduktion zwischen beiden Viren und das therapeutische Potential von spezifischen niedermolekularen Inhibitoren sollen untersucht werden, insbesondere die Aktivierung und Interaktionen von PERK und NF-κB Komponenten auf Proteinebene (Ziel 3). Die geplanten Arbeiten dienen in ihrer Gesamtheit der Evaluierung unserer zentralen Hypothese, dass humane CoV spezifische Gene erworben haben, die die antivirale Wirtszellantwort modulieren bzw. unterdrücken können. Eine fehlende oder inadäquate Kontrolle dieser zellulären Mechanismen (bei bestimmten CoV-infektionen in nichtnatürlichen Wirten) könnte somit das Auftreten schwerer Krankheitverläufe erklären.

Short summary:

Coronaviruses (CoVs) are a major cause of respiratory tract infections in humans. Lung pathology varies greatly between infections caused by common human CoVs (e.g., HCoV-229E) and zoonotic CoVs (e.g., MERS-CoV). The underlying mechanisms for strain-specific differences in human CoV-induced pathology remain poorly understood. The project aims to define CoV-regulated pathways and molecules and their interactions with CoV-encoded effectors in the lung to provide a framework for developing novel therapeutic strategies to treat coronaviral infections more effectively. Using advanced methods, including human lung cell culture systems, CoV reverse genetics, transcriptomics and single cell mRNA and protein-protein interaction analyses we were able to show that HCoV-229E induces a profound and genome-wide host response through NF-κB-dependent and -independent pathways that differ from classical cytokine-driven inflammatory responses. The data obtained in the first funding period suggest that CoVs fine-tune both the NF-κB system and the unfolded protein response (UPR) in a unique (and virus strain-specific) manner, which prompted us to evaluate the effects of inhibitors directed at NF-κB or the UPR in CoV-infected cells. Second, we determined the cellular lipidome of CoV-infected cells and identified (upregulated) specific lysophospholipids as important host cell factors that are required for the formation of intracellular membrane structures necessary for viral RNA synthesis. Third, we investigated CoV replicase gene-encoded enzymatic functions and established their involvement in (i) evading antiviral host reponses in human cells and/or (ii) modulating the cellular transcriptome. Fourth, we found that an alphacoronavirus-wide conserved accessory protein (called ap4 in HCoV-229E) modulates specific cellular pathways. In the next funding period, we will further define the functional interactions of specific CoV proteins with cellular pathways using HCoV-229E and MERS-CoV mutants lacking non-essential activities (Aim 1). To expand our analysis of human CoV strain-specific differences, we will systematically compare specific human lung cell types infected with HCoV-229E and MERS-CoV, focusing on differences in (i) viral replication, (ii) viral and cellular genome expression, and (iii) cell tropism (Aim 2). To reveal CoV strain-specific differences at the level of signaling and to explore the therapeutic potential of small molecule inhibitors, we will investigate the activation and interactions of PERK and NF-κB pathway components at the protein level (Aim 3). Collectively, these approaches will allow us to evaluate comprehensively our central hypothesis that human CoVs evolved a set of proteins that shape and thereby dampen (parts of) the virus-induced host cell response. Accordingly, failure to appropriately control and/or balance these mechanisms is expected to cause more severe lung injury in infections caused by (specific strains of) HCoVs.

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