Inhaltspezifische Aktionen

B1a - “Real Time-PCR zur Erfassung von MAP in unterschiedlichen Matrizes”

Projektleiter: Prof. Dr. med. vet. Michael Bülte

Stellvertretender Projektleiter: Dr. med. vet. Amir Abdulmawjood

Methodenplattform „Molekulargenetik“: Dr. med. vet. Amir Abdulmawjood


Zielsetzungen:
Ziel der Arbeiten sollte die Entwicklung und Validierung eines Real Time-PCR-Verfahrens (RT-PCR) zur Erfassung von MAP in Bioptaten humanen und bovinen Ursprungs, Rinderfaezes und Lebensmitteln sein. Dazu war auch die Etablierung mit einer internen Amplifikationskontrolle erforderlich. Weiterhin soll eine quantitative Erfassung des Erregers in verschiedenen Matrizes ebenso wie die Fragestellung nach der Lebensfähigkeit von MAP einbezogen werden. Für die Etablierung waren MAP-Prüfstämme humanen, bovinen und ovinen Ursprungs sowie negative Kontrollstämme zu berücksichtigen. Einen weiteren Schwerpunkt stellt die Aufbereitung von DNA/mRNA aus den unterschiedlichen Matrizes mit dem Ziel der Adaptierung des molekulargenetischen Verfahrens dar. Mit der so entwickelten Methodenkaskade sollte die Basis für vergleichende Untersuchungen zur Epidemiologie und Ätiologie von MAP geschaffen werden.

Bisherige Ergebnisse:
Nach entsprechenden Sequenzierungsstudien und –analysen wurden eigene Oligonukleotidprimerpaare entwickelt. Als Basis für die Etablierung der RT-PCR dienten die beiden Zielsequenzen ISMav2 und F57. Es konnte ein RT-PCR-Verfahren mit MAP-spezifischen Markern entwickelt und erfolgreich validiert werden, das sich durch hohe Sensitivität, Spezifität, Präzision und Robustheit auszeichnet. Gleichzeitig wurden die für eine diagnostische Qualitätssicherung zwingend erforderlichen internen Amplifikationskontrollen (IAK) etabliert, und zwar sowohl für ISMav2 als auch für F57. Für dieses PCR-Triplexverfahren können sowohl der kostengünstigere Fluoreszenzfarbstoff SybrGreen als auch TaqMan-Sonden eingesetzt werden. Gleichzeitig wurde ein bereits beschriebenes „nested PCR“-Verfahren etabliert, das als repräsentativ für das seinerzeitige diagnostische Leistungsvermögen für den molekularbiologischen Nachweis von MAP angesehen werden konnte. Bisher wurden über 200 Biopsieproben humanen sowie 21 bovinen Ursprungs und über 110 Kotproben von Rindern sowohl molekularbiologisch als auch mikrobiologisch-kulturell auf MAP untersucht. Aufgrund der erforderlichen Anzüchtungszeit (mehrere Monate) von MAP auf entsprechenden selektiven Nährmedien liegen erst einige Ergebnisse vor; diese belegen die Zuverlässigkeit des molekularbiologischen Nachweisverfahrens.

Veröffentlichungen:
a) Publikationen:
Bülte, M., Schönenbrücher, H. und A. Abdulmawjood (2005): From farm to fork – Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) als Zoonoserreger. Berl. Münch. Tierärztl. Wochenschr. 118, 337-385
Schönenbrücher, H., Abdulmawjood, A. und M. Bülte (2006): Entwicklung und Validierung eines Real Time-PCR-Verfahrens zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Fleischw. 86, 123-125
Schönenbrücher, H., Abdulmawjood, A. und M. Bülte (2006): Development and Validation of a new Triplex-Real Time-PCR-Assay for the Detection of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Manuskript eingereicht: Appl. Environm. Microbiol.

b) Tagungsbeiträge (Poster und Vorträge, Auswahl):
8th International Colloquium on Partuberculosis, 14.-18.08.2005, Denmark
Schönenbrücher, H., Adulmawjood, A. und M. Bülte (2005): Development and Evaluation of a Real Time-PCR-method for the detection of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Proceed. S. 573 (Poster)
46. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes “Lebensmittelhygiene” der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft, 27.-30.09.2005, Garmisch-Partenkirchen
Schönenbrücher, H., Abdulmawjood, A. und M. Bülte (2005): Entwicklung und Validierung eines Real Time-PCR-Verfahrens zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis, Proceed. S. 53-58 (Poster)
Füllgrabe, R., Schönenbrücher, H., Abdulmawjood, A. und M. Bülte (2005): Vergleichende Untersuchungen zum kulturellen Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Proceed. S. 374-378 (Poster)
DVG-Fachgruppe „Bakteriologie & Mykologie“ 15.-17.06.2006, Wetzlar
Schönenbrücher, H., Abdulmawjood, A. und M. Bülte (2006): „Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis: Entwicklung und Validierung eines Triplex-Real Time-PCR-Verfahrens, DVG-Fachgruppe (Vortrag)
47. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft, 26.-29.09.2006, Garmisch Partenkirchen
Bulander, K., Schönenbrücher, H., Abdulmawjood, A. und M. Bülte (2006): Molekularbiologischer und kultureller Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis aus Rinderkotproben (Prämierung als drittbestes Poster von 118).
58. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), 01.-04.10.2006, Würzburg
Füllgrabe, R., Schönenbrücher, H., Abdulmawjood, A. und M. Bülte (2006): Molecular and Cultural Detection of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in Patients with Inflammatory Bowel Disease and in Controls (Poster)
Schönenbrücher, H., Abdulmawjood, A. und M. Bülte (2006): Molecular detection of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis: Development and Validation of a Triplex-Real Time-PCR assay (Poster)

Dissertationen:
TÄ Regina Füllgrabe, Titel: “Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) und Morbus Crohn (MC): Kultureller und molekularbiologischer Nachweis von MAP aus humanen Darmbioptaten“ (Fertigstellung: Sommer 2007)
TÄ Korinna Bulander, Titel: „Vergleichende molekularbiologische und kulturelle Untersuchungen zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in Milchrinderbeständen“ (Fertigstellung: Herbst 2007)

Berücksichtigung in der Lehre:
Im Wintersemester 2004/2005, 2005/2006 und 2007/2008 ist die Thematik als eigenständiges Modul im Querschnittsfach „Lebensmittel“ bei der Ausbildung von Studierenden der Veterinärmedizin eingebracht worden. Daran beteiligt waren neben der eigenen Professur Prof. Dr. G. Erhardt (Institut für Tierzucht und Haustiergenetik, FB 09), Prof. Dr. K. Doll (Klinik für Wiederkäuer und Schweine, FB 10), Prof. Dr. H.-U. Klör (Zentrum für Innere Medizin, Medizinische Klinik und Poliklinik III, FB 11), Prof. Dr. E. Roeb (Zentrum für Innere Medizin, Schwerpunkt Gasteroenterologie, FB 11), Prof. Dr. M. Reinacher (Institut für Veterinärpathologie, FB 10), PD Dr. C. Menge (Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere, FB 10).

Drittmittelanträge/-einwerbungen:
1) Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV): Antrag auf Förderung innovativer Vorhaben zur Bekämpfung von Zoonosen bei Tieren im Rahmen des Programms zur Innovationsförderung vom 08. Juni 2006, mit dem Thema „Frühdiagnostik von Infektionen mit Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) bei Rindern“
Status: befürwortet
Antragsvolumen: 1,3 Mio. € mit 3xBAT IIa, 1,5xBAT Vc
Projektkoordinator: Prof. M. Bülte
Beteiligte Arbeitsgruppen: Prof. Dr. R. Bauerfeind, PD Dr. C. Menge (FB 10, JLU, Gießen)
Prof. Dr. K. Doll (FB 10, JLU, Gießen)

2) Ministerium für Umwelt und Forsten des Landes Rheinland-Pfalz: „Optimierung von DNA-Extraktionsverfahren zum Nachweis von Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) aus Rinderkot“
Status: bewilligt
Antragsvolumen: 20.700 €
Projektkoordinator: Prof. M. Bülte

3) Bundesministeruim für Bildung und Forschung (BMBF): Antrag im Rahmen des Förderschwerpunktes „Forschungsverbünde zu zoonotischen Infektionskrankheiten vom 01.04.2006 mit dem Thema „Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis – from Johne’s disease to Crohn’s disease -„
Status: bewilligt zum 01.05.2007 (voraussichtlich)
Antragsvolumen: ca. 989.000 € (IFTN 128.000 €)
Mit 3xBAT IIa, 0,5x BAT Vc
Projektkoordinator: PD Dr. R. Goethe, Tierärztliche Hochschule (TiHo) Hannover
Beteiligte Arbeitsgruppen: Prof. Dr. med. vet. Gerald-F. Gerlach, Hannover (TiHo), Dr. Siegfried Weiss, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig, Dr. Mathias Hornef, Institute for Medical Microbiology and Hygiene University of Freiburg, Prof. Dr. med. Elke Roeb, Medical Clinic II, Gastroenterology, Justus-Liebig-University of Gießen, Prof. Dr. med. vet. Michael Bülte, Institute of Veterinary Food Science (IFTN) Justus-Liebig-University of Gießen, Dr. med. vet. Heike Köhler, Reference Laboratory for Paratuberculosis (NRLP) Friedrich-Loeffler-Institut, Jena

4) Schaumann-Stiftung als Forschungsspende für die Arbeit mit der Klinik für Wiederkäuer der JLU Gießen, Prof. Dr. K. Doll in form eines MAP-Biopsie-Projektes
Status: bewilligt
Antragsvolumen: 10.000 € (IFTN 6.000 €)

5) in Vorbereitung für EU: ”Investigation of methods useful for inactivating Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in food products” (2007)
Status: Vorgesehen für das 7. EU-Rahmenprogramm
Antragsvolumen für IFTN: ca. 290.000 € mit 1xBAT IIa, 0,5x BAT Vc
Projektkoordinator: Ass. Prof. J. Ikonomopoulos, School of Animal Science, Agricultural University of Athen


Sonstiges:

Weitere Informationen erhalten Sie im Institut für tierärztliche Nahrungsmittelkunde.
Erfindungsmeldung in 2006 über die selbst entwickelte RT-PCR mit dem Ziel der Patentierung über TransMIT GmbH, Gießen.

 

  1. Erfindungsmeldung
  2. Förderung des postdoc Aufenthaltes von Dr. H. Schönenbrücher am Animal Disease Center Ames, Iowa, USA durch die Engemann-Stiftung
  3. DAAD-Stipendium für Jorge Fernandez-Silva, Universidad de Antioquia Kolumbien
  4. Ladung von Prof. Dr. M. Bülte in den Verbraucherausschuß des Deutschen Bundestages im März 2005 zum Thema: „Paratuberculose und Morbus Crohn?“
  5. Nationale und internationale Vernetzung sind in der folgenden Abbildung dargestellt: